Ⅰ相代謝穩(wěn)定性研究原理及實(shí)驗(yàn)方法

1 概述

1.1 藥物代謝研究簡(jiǎn)介

藥物代謝研究是創(chuàng)新藥物研發(fā)的重要內(nèi)容，它不僅決定了創(chuàng)新藥物制劑研發(fā)的成敗，而且與創(chuàng)新藥物研發(fā)的速度和質(zhì)量有密切關(guān)系。因而，藥物代謝研究在新藥研發(fā)工程中具有*的重要作用，研究藥物代謝對(duì)于了解藥物在體內(nèi)的變化過(guò)程至關(guān)重要。

藥物代謝研究的方法主要分為體內(nèi)和體外兩種。體內(nèi)代謝法因藥物在生物體內(nèi)的分布較廣，加上代謝轉(zhuǎn)化的器官和酶系的多樣性，使藥物及其代謝產(chǎn)物在體內(nèi)的濃度比較低，代謝產(chǎn)物的檢測(cè)具有一定的困難。體外代謝法在短時(shí)間內(nèi)可以得到大量的代謝產(chǎn)物，且代謝條件可控，代謝體系比較“干凈"，代謝物易于分離、提取，有利于代謝途徑研究及代謝產(chǎn)物結(jié)果的確定等，因而，體外代謝法具有突出的*性。

由于肝臟是藥物代謝的主要場(chǎng)所，體外代謝模型多以肝臟為基礎(chǔ)。目前，研究體外代謝方法主要有：肝微粒體體外溫孵法、重組P450酶體外溫孵法、肝細(xì)胞體外溫孵法、肝臟離體灌流法和肝切片法。其中，肝微粒體體外溫孵法與其他體外代謝方法相比，酶制備簡(jiǎn)單，代謝過(guò)程快，重現(xiàn)性好，易大量操作，同時(shí)可用于藥物代謝酶的抑制及體外清除等方面的研究，因而在實(shí)際工作中應(yīng)用較為普遍。

1.2 藥物代謝

藥物代謝，又稱(chēng)藥物的生物轉(zhuǎn)化（biotransformation），是指藥物經(jīng)過(guò)體內(nèi)吸收、分布之后，在藥酶的作用下經(jīng)歷化學(xué)結(jié)構(gòu)變化的過(guò)程，是藥物從體內(nèi)消除的主要方式之一。藥物在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化，分為Ⅰ相代謝反應(yīng)和Ⅱ相代謝反應(yīng)。

肝臟是藥物代謝的重要器官，是機(jī)體進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的主要場(chǎng)所，含有參與藥物代謝Ⅰ相代謝和Ⅱ相代謝的各種酶。在肝臟中，參與藥物代謝的Ⅰ相和Ⅱ相代謝酶中以P450酶重要，它是一種以鐵卟啉為輔基的蛋白質(zhì)。P450酶存在明顯的種屬、性別和年齡的差異，其中以種屬差異表現(xiàn)明顯，不同種屬的P450同工酶的組成不同，因此藥物在不同種屬的動(dòng)物和人體內(nèi)的代謝產(chǎn)物可能是不同的。

1.3 藥物的Ⅰ相代謝

藥物在Ⅰ相代謝反應(yīng)中主要發(fā)生氧化、還原和水解的反應(yīng)，經(jīng)過(guò)Ⅰ相代謝反應(yīng)，藥物可能帶有一些極性基團(tuán)，如羥基、羧基等。

氧化反應(yīng)是多見(jiàn)的第Ⅰ相反應(yīng)，單加氧酶系是氧化異源物重要的酶，單加氧酶主要存在于滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的微粒體中，能催化烷烴、烯烴、芳烴和類(lèi)固醇等多種物質(zhì)進(jìn)行氧化。由細(xì)胞色素P450、NADPH+H⁺、NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶（以FAD為輔基的黃酶），催化基本反應(yīng)為：

RH+O₂+NADPH+H⁺→ROH+NADP⁺+H₂O

單加氧酶能直接激活氧分子，使其中一個(gè)氧原子直接加入底物分子中形成羥化物或環(huán)氧化物，另一個(gè)氧原子則被NADPH還原為水。由于一個(gè)氧分子發(fā)揮了兩種功能，故單加氧酶系又稱(chēng)為混合功能氧化酶；又因底物的氧化產(chǎn)物是羥化物，所以又稱(chēng)為羥化酶。加單氧酶的反應(yīng)見(jiàn)圖1：

圖1 加單氧酶的反應(yīng)

肝細(xì)胞微粒體內(nèi)存在的還原酶主要有硝基還原酶和偶氮還原酶，是第Ⅰ相反應(yīng)的主要還原酶，能使硝基化合物和偶氮化合物還原生成胺類(lèi)（見(jiàn)圖2）。

圖2 硝基苯和偶氮苯的還原反應(yīng)

肝微粒體中含有多種水解酶，如酯酶、酰胺酶、糖苷酶等，可分別催化酯類(lèi)、酰胺類(lèi)、糖苷類(lèi)化合物的水解（見(jiàn)圖3），以降低或消除其生物活性。  

                                                                       圖3 乙酰水楊酸的水解反應(yīng)

2 Ⅰ相代謝穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)原理

肝藥酶CYP即細(xì)胞色素P450氧化酶（CYP450），屬于單加氧酶（momooxygenase），也稱(chēng)肝微粒體混合功能氧化酶，多位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體內(nèi)壁上，參與藥物、致癌物、類(lèi)固醇激素和脂肪酸等多種內(nèi)、外源性物質(zhì)代謝。肝藥酶CYP氧化還原酶（POR）是所有肝微粒體酶的電子供體，通過(guò)還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）將電子傳遞給CYP450酶，CYP450酶得到電子后再與底物發(fā)生氧化還原反應(yīng)，從而發(fā)揮代謝活性。

肝微粒體中包含了大部分Ⅰ相酶，其中重要的是以CYP450為主要成分的微粒體混合功能氧化酶系統(tǒng)，在用肝微粒體進(jìn)行研究時(shí)，如加入相應(yīng)的輔助因子NADPH，則可重組體外代謝體系，從而通過(guò)體外溫孵法進(jìn)行Ⅰ相代謝穩(wěn)定性研究。

3 肝微粒體體外溫孵法實(shí)驗(yàn)方法描述

肝微粒體體外溫孵法是采用肝微粒體，輔以NADPH再生系統(tǒng)，在體外模擬生理環(huán)境條件進(jìn)行代謝反應(yīng)，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的反應(yīng)后，采用HPLC、HPLC-MC和HPLC-MC/MC測(cè)定溫孵液中原型藥物和其代謝產(chǎn)物，并對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行初步的分析和鑒定的方法。

3.1 肝微粒體制備

微粒體是指在細(xì)胞勻漿和差速離心過(guò)程中獲得的由破碎的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自我融合形成的近似球形的膜囊泡狀結(jié)構(gòu)，是異質(zhì)性的集合體。它包含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和核糖體兩種基本成分，在體外實(shí)驗(yàn)中具有蛋白質(zhì)合成、蛋白質(zhì)糖基化和脂類(lèi)合成等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的基本功能。目前，制備肝微粒體常用的方法是差速離心法。具體制備流程見(jiàn)下圖（圖4）：

圖4 肝微粒體制備流程圖

3.2 體外孵育體系的建立

Ⅰ相代謝穩(wěn)定性研究的肝微粒體體外孵育體系，是由制備的肝微粒體輔以氧化還原型輔酶，在模擬生理溫度及生理環(huán)境的條件下進(jìn)行生化反應(yīng)的體系。

推薦使用的孵育體系為：每個(gè)孵育體系總體積為200 µL，體系包括0.1M PH 7.4 的磷酸緩沖液，NADPH發(fā)生系統(tǒng)（1mM NADP，5 mM的6-磷酸葡萄糖，1 U/mL 6-磷酸葡萄糖脫氫酶，3.3 mM的氯化鎂）；0.5 mg/mL的肝微粒體蛋白；合適濃度的待測(cè)物，于37°C水浴孵育，每個(gè)樣品平行3次，以不包含NADPH發(fā)生系統(tǒng)的樣品作為陰性對(duì)照。于預(yù)設(shè)的反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，如0，5，10，15，30，60 min后加入等體積預(yù)冷的乙腈終止反應(yīng)。

3.3 原型藥物或代謝產(chǎn)物的檢測(cè)

采用HPLC、HPLC-MC和HPLC-MC/MC測(cè)定溫孵液中原型藥物和其代謝產(chǎn)物。圖5為采用LC-MS/MS測(cè)定藥物在人、犬和大鼠肝微粒體中的代謝情況，從圖上可知，藥物在三種肝微粒體中均存在明顯代謝，但不同種屬間又存在顯著差異。

                                                         圖5藥物在人，犬，大鼠肝微粒體中的代謝情況

4 匯智和源/匯智泰康Ⅰ相代謝穩(wěn)定性試劑盒簡(jiǎn)介

北京匯智和源生物技術(shù)有限公司針對(duì)藥物代謝研究的需要，以肝微粒體體外溫孵法為指導(dǎo)，開(kāi)發(fā)了一款專(zhuān)門(mén)用于Ⅰ相代謝穩(wěn)定性研究的試劑盒，該產(chǎn)品可直接用于藥物的Ⅰ相代謝穩(wěn)定性研究，省去了肝微粒體制備和試劑配制的繁瑣過(guò)程，大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期，且試劑盒各組成成分經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)，符合Ⅰ相代謝穩(wěn)定性研究試驗(yàn)要求，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性好。

4.1 產(chǎn)品說(shuō)明

本產(chǎn)品提供了藥物Ⅰ相代謝研究用到的肝微粒體、NADPH再生系統(tǒng)及其它組分，可直接用于藥物Ⅰ相代謝穩(wěn)定性的研究。本產(chǎn)品可提供肝微粒體有：人肝微粒體、恒河猴肝微粒體、比格犬肝微粒體、大鼠肝微粒體和小鼠肝微粒體，可根據(jù)實(shí)際需求，選擇不同種屬的肝微粒體。

4.2 試劑盒優(yōu)勢(shì)

便捷——本試劑盒省去了肝微粒體制備和試劑配制時(shí)間，可以直接使用，大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期。

準(zhǔn)確——本試劑盒各成分均經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性高。

穩(wěn)定—— 本試劑盒穩(wěn)定性強(qiáng)、易于運(yùn)輸和保存。

4.3 產(chǎn)品組成

50反應(yīng)/盒，200μL/反應(yīng)。

4.4 產(chǎn)品使用說(shuō)明

本產(chǎn)品需于-70℃冰箱冷凍保存，切記避免反復(fù)凍融。試驗(yàn)具體操作如下：

4.4.1 試驗(yàn)組

1）冰浴融化試劑盒各組分，置于冰上待用；

2）除微粒體外，將孵育體系其它各組分按照配比混合并吹吸混勻，于37℃預(yù)孵育5min；

例：200μL孵育體系配制：

注：a.體系中有機(jī)溶劑加入量不得大于1%。

   b.若實(shí)際需要n個(gè)孵育體系，則需配置n＋1個(gè)體系。

3）將以上混合液195μL/管分裝至1.5mL離心管中，于37℃水浴中保溫， 5μL/反應(yīng)加入肝微粒體，吹吸3次混勻于37℃水浴條件下啟動(dòng)代謝反應(yīng)，使用秒表計(jì)時(shí)；

4）于設(shè)定孵育時(shí)間點(diǎn)，向孵育體系中加入200μL預(yù)冷的乙腈終止反應(yīng)（預(yù)冷乙腈：孵育體系體積=1:1）。

4.4.2 對(duì)照組

1）陽(yáng)性對(duì)照組：將受試物換為陽(yáng)性底物；

2）陰性對(duì)照組：不加A液、B液；

3）空白對(duì)照組：只包含底物和PBS緩沖液。

4.5 運(yùn)輸條件

干冰運(yùn)輸。

4.6 使用注意事項(xiàng)

1）驗(yàn)開(kāi)始前，請(qǐng)自行準(zhǔn)備1.5mL離心管、不同規(guī)格槍頭、乙腈、37℃水浴鍋等。

2）產(chǎn)品僅供科研使用，不能用于人體及動(dòng)物的治療或臨床診斷。

3）用前，需于冰浴條件下解凍并混合均勻。

4）-70℃冰箱冷凍保存，切勿反復(fù)凍融。

5)用過(guò)程中，也可根據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)需求調(diào)整各組分的加入量。