近年來，人們越來越認識到，除了藥物代謝酶以外，藥物轉運體在許多藥物的吸收、分布和排泄中發(fā)揮著重要的作用。由于多態(tài)性或藥物-藥物相互作用（DDI）導致的轉運蛋白功能喪失已被證明會導致藥物處置、療效甚至毒性發(fā)生顯著變化，進一步強調了藥物轉運體研究的重要性，監(jiān)管機構也期望新藥申請需進行轉運體的體外研究，以評估轉運蛋白介導的DDI的潛在風險。

轉運體介紹

轉運體（transporter）是一類表達于細胞膜的功能蛋白，在人體全身組織中均有表達，通過影響藥物的吸收、分布和消除而影響藥物的藥代動力學和藥效學特征。介導藥物進入細胞的轉運體可將藥物攝取進入組織器官，從而提升藥物生物利用度以及改變藥物的組織分布，屬于可溶性載體（Solute carrier，SLC）轉運體；介導藥物外排的轉運體可利用水解ATP的能量將某些藥物排出細胞，從而降低細胞內藥物濃度，產生耐藥性，屬于ATP結合盒（ATP binding cassette，ABC）轉運體。

可溶性載體超家族是人類細胞膜上最重要的膜轉運體家族之一，它參與了細胞間的物質運輸、能量傳遞、營養(yǎng)代謝、信號傳導等重要生理活動。SLC超家族包括 52個亞家族，共有 400多名成員。臨床應用中與DDI有關的溶質轉運體大多是攝取型轉運體，包括有機陽離子轉運體（organic cation transporter, OCT)2；有機陰離子轉運體（organic anion transporter, OAT) 1/3；有機陰離子轉運多肽（organic anion transporting polypeptide, OATP) 1B1/1B3；寡膚轉運體（oligopeptide transporter, PEPT)1 等。其中，多藥及毒性化合物外排轉運體（multidrug and toxin extrusion proteins, MATE) 1/2-K 是SLC轉運體，但屬于外排型轉運體。

ATP結合盒（ATP Binding Cassette，ABC）轉運體是最大的轉運體超家族，分為ABCA~G共7個亞家族，屬于主動運輸轉運體，依賴于ATP發(fā)揮轉運活性，以逆濃度梯度形式將藥物排出體外。參與藥物轉運的ABC轉運體主要包括P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)、乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)、多藥耐藥相關蛋白(multidrug resistance protein，MRP)等。

圖1 藥物轉運蛋白在人體各組織器官中的分布

各國指導原則對轉運體研究的要求

藥物轉運體是決定細胞內藥物積累的關鍵因素，其活性往往與藥物的治療效果、毒性及藥物-藥物相互用 (Drug-drug interaction，DDI) 直接相關。美國、歐洲和中國的藥品監(jiān)管部門也相繼出臺指導原則，建議體外評估主要轉運體與受試藥物之間潛在的相互作用，為體內研究提供參考。

表1 各國指導原則對轉運體研究的建議

“√"必須考慮；“×"不考慮

轉運體研究體外模型

在開始轉運體研究之前，一個重要的考慮就是選擇合適的體外試驗系統(tǒng)。目前，指導原則推薦的體外評估由轉運體引起的DDI模型主要包括膜囊泡系統(tǒng)、基于極化細胞的雙向轉運系統(tǒng)及單向攝入的細胞系統(tǒng)等。

3.1 膜囊泡系統(tǒng)

轉染轉運體蛋白的細胞的外翻膜囊泡系統(tǒng)是評價在研藥物是否為ABC轉運體（如P-gp、BCRP、BSEP等）的底物或抑制劑的常用模型。通常，膜囊泡可通過感染昆蟲細胞（如Sf9或Sf21），或轉染哺乳動物細胞（如HEK293、HeLa、V79或MDCK）等進行制備。囊泡外翻后，原本表達在胞內的轉運體將被外翻至囊泡外，與藥物共孵育時，藥物直接作用于外翻轉膜上的轉運蛋白，轉運蛋白可以將藥物轉運到囊泡內，可檢測藥物的吸收而非外排，即測定囊泡內藥物含量即可反應轉運體對藥物的作用。

圖2 膜囊泡系統(tǒng)的研究方案

3.2 基于極化細胞的雙向轉運系統(tǒng)

?

基于極化細胞的雙向轉運系統(tǒng)是指能夠自發(fā)極化形成完整細胞單層的細胞系，如Caco-2、MDCK、LLC-PK1等。將細胞接種在Transwell小室上，培養(yǎng)至形成完整的極化細胞單層，將受試藥物添加到單層細胞的頂端（apical，AP）或基底側（basolateral，BL），測量滲透入接收室中的藥量，根據AP→BL（吸收）和BL→AP（流出）兩個方向上的表觀滲透系數（apparent permeability coefficient，Papp）計算外排率（efflux ratio，ER），評價化合物是否為該ABC轉運體底物。此外，通過測量探針底物在BL→AP方向的凈流量或ER值的變化，也可以進行化合物對特定轉運體抑制作用的評估。

3.3 單向攝入的細胞系統(tǒng)

將重組轉運體基因穩(wěn)定或瞬時轉染到不同的細胞系，可用于評價在研藥物是否為SLC轉運體（如OCTs、OATs、OATPs和MATEs）的底物或抑制劑。由于HEK293和CHO細胞具有低內源性轉運蛋白活性并且易于維持的特點，常用于表達攝取轉運蛋白。當評價藥物是否為轉運體的底物時，應將轉染細胞中的藥物攝取與親代或空載體轉染細胞系進行比較，且應比較有或無轉運體抑制劑時的藥物攝取。當評估藥物是否為轉運體的抑制劑時，僅使用轉運體轉染的細胞系評價已知探針底物的攝取便已足夠。

3.4三明治培養(yǎng)肝細胞

肝細胞中除了含有豐富的藥物代謝酶，還表達多種重要的轉運體。三明治培養(yǎng)是將肝細胞培養(yǎng)于兩層膠原之間，底層為鼠尾膠使肝細胞貼壁，上層為Matrigen膠使其形成肝板樣結構。培養(yǎng)幾天后，肝細胞形成完整膽小管網絡并同時保持緊密連接，且肝臟轉運體正常表達并定位于恰當的膜區(qū)域，可用于轉運體功能研究。

試驗系統(tǒng)——膜囊泡

應用

•評估藥物與外排轉運蛋白（ABC轉運蛋白）的相互作用

•確定底物特異性和確定抑制劑

優(yōu)勢

•適用于低通透性的化合物

•細胞毒性化合物不會影響實驗系統(tǒng)

•重組系統(tǒng)中的高轉運蛋白表達水平，轉運蛋白表達可以在某些表達系統(tǒng)中“滴定"

•可以制備大量并冷凍保存以備隨時可用

•能夠預加載各種緩沖液和物質

•準確測定動力學，因為孵育緩沖液中的底物可以直接進入活性位點

局限性

•不適合具有高滲透性或高非特異性結合的化合物

•昆蟲細胞中的低糖基化可能改變運輸特性

•表達系統(tǒng)中的內源性運輸活性可能使數據解釋復雜化•轉運蛋白活性因批次而異

•如果在室內制備（超離心或氮空化彈），則需要特殊設備

試驗系統(tǒng)——單向攝入的細胞系統(tǒng)

應用

•評估藥物與攝取轉運蛋白（OATPs,OCTs, OATs，NTCP）的相互作用

•確定底物特異性并確定抑制劑

優(yōu)勢

•允許調查單個轉運蛋白的特性

•穩(wěn)定轉染的細胞系可以傳代多次使用或冷凍保存

•低復雜性

局限性

•宿主細胞內源性轉運蛋白活性可能使數據解釋復雜化

•穩(wěn)定重組細胞系的產生和表征是耗時的（>1個月）

•轉運蛋白表達水平在實驗室之間有所不同

試驗系統(tǒng)——基于極化細胞的雙向轉運系統(tǒng)

應用

•評估外排轉運體的藥物轉運

•確定底物特異性并確定抑制劑

•定性地研究攝取和外排轉運體之間的相互作用

優(yōu)勢

•運輸受非特異性結合的影響較小，因為只有穿過細胞單層的化合物才被測量

•適合評估主動運輸與擴散

局限性

•內源性轉運蛋白活性可能使數據解釋復雜化

•需要評估質量平衡

•復雜的動力學研究

•除非攝取轉運蛋白共表達，否則不適合低通透性的化合物

試驗系統(tǒng)——肝細胞三明治模型

應用

•評估肝臟攝取/外排和膽道排泄

•識別涉及肝膽藥物處置的轉運蛋白和限速步驟

•評估由于轉運蛋白抑制而引起的藥物性膽汁淤積的可能性

•調查攝取和外排轉運蛋白之間的相互作用

•評估藥物的細胞內濃度、Kpuu和亞細胞分布

優(yōu)勢

•系統(tǒng)模擬膽汁排泄，可以測量膽道清除率

•表達攝取和外排轉運蛋白、代謝酶和調節(jié)機制的整體系統(tǒng)

•可以使用從感興趣的物種中冷凍保存或新鮮分離的肝細胞

•適用于識別轉運蛋白抑制劑（競爭性和非競爭性）和誘導劑

•在臨床前物種和人類中證明了體外對體內的相關性

局限性

•需要一定的培養(yǎng)時間才能在合適的膜域中正確定位轉運蛋白

•不太適合低清除率的化合物（特別是如果涉及代謝）

•酶/轉運蛋白的表達/活性可能會受到培養(yǎng)條件的調節(jié)

轉運體研究的關鍵點把控

4.1 ABC轉運體研究的關鍵點

目前，體外評估由ABC轉運體引起的DDI的常用模型為膜囊泡系統(tǒng)、基于極化細胞的雙向轉運系統(tǒng)和三明治培養(yǎng)肝細胞。在實際應用過程中，我們需綜合多方因素，選擇合適的試驗系統(tǒng)。當進行ABC轉運體的體外研究時，以下幾點需要關注：

滲透性和吸附：當評估轉運體是否為在研藥物的底物時，若所測試藥物具有高滲透性或強非特異性吸附等特性，可能會因為背景值較高而造成假陰性的結果。如使用膜囊泡研究具有高滲透性活強非特異性吸附的藥物，可能會因為被動擴散跨膜進入膜囊泡導致高背景，掩蓋轉運體介導的藥物轉運，從而導致在囊泡模型中得到了假陰性的結果。

跨膜能力：如果在研藥物分子量大，不易透過細胞膜時，細胞模型將無法研究藥物的轉運機制，而膜囊泡模型則不受化合物滲透性的影響。藥物跨膜能力較差，能夠進入到細胞內的游離藥物濃度可能較低，而在膜囊泡模型中，藥物可以與轉運體的結合位點直接接觸發(fā)揮其作用，并不需要透膜的過程。

輔因子：在設計實驗時，應考慮ABC轉運蛋白對共底物和輔因子的要求。例如，活細胞中以毫摩爾濃度存在的還原性谷胱甘肽是MRP1、MRP2、MRP2和MRP4轉運某些底物所必需的；在某些情況下，谷胱甘肽轉運與藥物轉運有關。因此，試驗中需額外添加適量的還原型谷胱甘肽或s -甲基谷胱甘肽。

4.2 SLC轉運體研究的關鍵點

體外評估由SLC轉運體引起的DDI的常用模型為單向攝入的細胞系。當使用單向攝入的細胞系統(tǒng)進行攝取研究時，以下幾點值得考慮：

溶解度：在試驗設計時，應考慮受試物的溶解度。為增加化合物的溶解度，可在不影響細胞活力或轉運體功能的情況下添加有機溶劑，如二甲基亞砜。對于溶解度低的化合物，可以在孵育緩沖液中加入白蛋白或其他賦形劑，但需要確定化合物處于未結合濃度，否則數據解釋將變得復雜。

試驗程序：為保證試驗結果的準確性，試驗過程需遵循一致的程序，盡量減小試驗誤差導致的影響。攝取速率通常歸一化為細胞總蛋白（mg）或細胞數，以便與親代或空載體轉染細胞的攝取相比，準確測定轉運蛋白特異性攝取。

孵育時間：為了確定受試物的抑制作用，需根據受試物特性，如滲透性、是否為轉運體底物等，考慮其與抑制劑的孵育時間（預孵育和/或共孵育）。

IPHASE轉運體產品

作為體外研究生物試劑引-領者，IPHASE以HEK293為載體，成功推出全面匹配指導原則需求的SLC轉運體細胞（OATP1B1、OATP1B3、OAT1、OAT3、OCT2、MATE1和MATE2-K）、ABC轉運體囊泡（P-gp和BCRP）及配套產品，助力藥物轉運體介導的DDI研究。

參考資料：

[1]洪梅,王旭陽.藥物轉運體的翻譯后處置及相關關鍵位點研究進展[J].華南農業(yè)大學學報,2022,43(06):160-172.

[2] Brouwer K L R , Keppler D , Hoffmaster K A ,et al.In vitro methods to support transporter evaluation in drug discovery and development.[J].Clinical Pharmacology & Therapeutics, 2013, 94(1).DOI:10.1038/clpt.2013.81.

[3]《藥物相互作用指導原則2020》

IPHASE/匯智和源憑借多年的研發(fā)經驗，推出了多領域、多種類的高-端科研試劑，為藥物早期研發(fā)提供篩選工具，為生命科學領域的探索提供新材料、新方法和新手段，為食品、藥品、化學品等的遺傳毒性研究提供便捷產品，望廣大科研工作者咨詢。

發(fā)    文    章    得    獎    勵

凡使用本公司產品，在國內及國際刊物上發(fā)表論文（論文發(fā)表日起一年內），并注明產品屬于IPHASE BIOSCIENCES Co.,Ltd. / 匯智和源生物技術（蘇州）有限公司所有，即可申請獎勵。根據發(fā)表刊物影響因子不同，給予不同金額獎品：

非SCI論文及IF≤5分，500元禮品；

5分＜IF≤8分 800元禮品；

8分＜IF≤10分 1000元禮品；

IF≥10分 2000元禮品；

注：①禮品卡也可兌換同等金額產品購買抵用券；

      ②如遇我司公司名稱書寫不規(guī)范或不是第一作者

        等情況，對應給予獎品金額將發(fā)放50%；

活動多多，禮品豐厚，快來參與吧！

關    于    我    們

匯智和源，致力于為創(chuàng)新藥研發(fā)企業(yè)及生命科學研究機構提供高品質的生物試劑，IPHASE為公司核心品牌，品牌宗旨“Innovative Reagents For Innovative Research"。